一、基因敲降的前期準備工作相同

1.1 生物信息學(xué)分析目標(biāo)基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)送過程中是否有表達。

1.2 收集斑馬魚早期發(fā)育胚胎（通常為 48 hpf 前的胚胎），提取總 RNA，然后進行體外轉(zhuǎn)錄（RT）。

1.3 設(shè)計檢測目標(biāo)基因表達的 PCR 引物，以 1.2 獲得的 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增，確認目標(biāo)基因在早期有表達。

二、MO 法與 CRISPRi 法的敲降原理不同

2.1 MO 是在轉(zhuǎn)錄后水平上敲降基因的功能（MO-Spl 阻遏原始轉(zhuǎn)錄本的剪接，MO-Atg 阻遏成熟轉(zhuǎn)錄本的翻譯）（基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控）

2.2 CRISPRi 是在轉(zhuǎn)錄水平上敲降基因的功能（抑制基因的轉(zhuǎn)錄）(基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控）。

三、敲降工具有效性驗證的方法不同

3.1 嗎啡啉敲降法（確認有效性）的技術(shù)路線

抑制翻譯的 MO（MO-Atg）和抑制剪接的 MO（MO-Spl）二者敲降基因的有效性評價方法不同。抑制剪接的 MO（MO-Spl）的有效性評價方法是通過 RT-PCR 直接檢測原始mRNA轉(zhuǎn)錄本的正常剪接是否被改變；抑制翻譯的 MO（MO-Atg）的有效性評價通常需要通過蛋白質(zhì)印跡法進行檢測。但是，由于適用于斑馬魚的抗體很少，過去一般通過報告基因法來進行有效性評價（參見我們發(fā)表的論文 Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )， 但后來斑馬魚領(lǐng)域給出的 MO 使用指南（見已發(fā)表的研究論文：Stainier et al., 2017. Plos Genetics, 13(10): e1007000）指出這種報告基因評價法缺乏特異性，因而不再推薦該報告基因評價方法。也正是由于沒有相應(yīng)比較方便的評價方法，一般不推薦此種抑制翻譯（MO-Atg）   的 MO 敲降法。確認抑制剪接的 MO（MO-Spl）敲降基因有效性的技術(shù)路線如下：

3.1.1 分析斑馬魚目標(biāo)基因的基因組組成（外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)），然后針對該基因，設(shè)計阻  遏原始轉(zhuǎn)錄本剪接的嗎啡啉（morpholino）（MO-Spl）。

注：MO-spl 不能阻止母源轉(zhuǎn)錄本的翻譯，如果要阻止母源轉(zhuǎn)錄本的翻譯，需要設(shè)計阻遏原始轉(zhuǎn)錄本翻譯的嗎啡啉（MO-Atg）。

3.1.2 訂購嗎啡啉 MO-Spl 或 MO-Atg 和標(biāo)準對照 MO。

3.1.3 將不同濃度的 MO-Spl 注射入斑馬魚受精卵（標(biāo)準對照 MO 僅注射最高濃度）

3.1.4 待注射胚胎發(fā)育至特定時期（優(yōu)選 48 hpf 前的某些時期），收集胚胎，提取總 RNA， 然后進行體外轉(zhuǎn)錄（RT）。

3.1.5 按 1.3 已建立的方法進行 RT-PCR 擴增，確認目標(biāo)基因的原始轉(zhuǎn)錄本的正常剪接是否被阻遏（發(fā)生異常剪接）。同時，設(shè)置檢測管家基因表達作為內(nèi)參對照，確認整個 RT-PCR 過程正常。

注：如果是使用 MO-Atg，則無簡單易行的有效性檢測方法（一般不做有效性檢測，僅開展特異性檢測）。

3.1.6 分析 3.1.5 的實驗結(jié)果，確定 MO 敲降工具的有效性，以及實現(xiàn)有效敲降的最低注射濃度。

3.2 CRISPRi 敲降法（確認有效性）的技術(shù)路線

CRISPRi 敲降的有效性可以通過RT-PCR 法檢測目標(biāo)基因表達水平是否被有效下調(diào)來進行直接評價。一般使用普通半定量 RT-PCR 即可，確有需要，可以考慮定量 RT-PCR 法確認敲降程度。

3.2.1 分析目標(biāo)基因的基因組結(jié)構(gòu)，確定目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄起始位點和/或 5’UTR 位置。 根據(jù)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的特征，設(shè)計 sgRNA 識別位點---CRISRP 序列的設(shè)計（不少于 4 個）。

3.2.2 體外合成至少 4 條不同的 sgRNA（每基因）和 dCas9-Eve mRNA。

3.2.3 將 4 條 sgRNA 按不同濃度和 dCas9-Eve mRNA 混合后共同注射斑馬魚受精卵。同時以相同濃度的 dCas9-Eve mRNA 注射受精卵作為空白對照。

3.2.4 待注射胚胎發(fā)育至特定時期（優(yōu)選 48 hpf 前的某些時期），收集胚胎，提取總 RNA， 然后進行體外轉(zhuǎn)錄（RT）。

3.2.5 按 1.3 已建立的方法進行 PCR 擴增，確認目標(biāo)基因的表達水平是否被有效抑制（阻遏轉(zhuǎn)錄）。同時，設(shè)置檢測管家基因表達作為內(nèi)參對照，確認整個 RT-PCR 過程正常。

3.1.6 分析 3.2.5 的實驗結(jié)果，確定 CRISPRi 敲降工具的有效性，以及實現(xiàn)有效敲降的最低注射濃度。

四、CRISPRi 敲降方法的特異性優(yōu)于 MO 法的特異性

基因敲降方法的特異性需要通過表型拯救的方法來回答。之所以需要表型拯救，是因為需要排除基因敲降的表型是由于敲降工具的脫靶或者敲降試劑本身的毒性而導(dǎo)致的非特異   表型，換句話說，要排除敲降表型是源于基因敲降工具的脫靶或者試劑本身的毒性所造成的   這種可能。拯救的基本實驗策略是：在基因敲降的基礎(chǔ)上，過表達被敲降的基因（通常是同時顯微  注射目標(biāo)基因的戴帽 mRNA），然后觀測原來出現(xiàn)的表型是否被恢復(fù)（或有所恢復(fù)）至正常（參見我們發(fā)表的論文 Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )。如果基因敲降的表型在過表達目標(biāo)基因的 mRNA 后有很好的拯救，那么可以確認敲降方法是特異的。基于基因組編輯技術(shù)的 CRISPRi 敲降方法，一般同時注射 4 個 sgRNA + dCas9-Eve mRNA。先前的很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單個 sgRNA 引導(dǎo) dCas9-Eve 所發(fā)揮的抑制基因表達的功能遠沒有多個 sgRNA 同時引導(dǎo) dCas9-Eve 發(fā)揮的抑制功能強（參見我們發(fā)表的論文 Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，這種多個 sgRNA 的協(xié)同作用決定了CRISPRi法脫靶作用可以忽略，而 RNA 本身的毒副作用是完全可以進行對照的（使用一組僅注射dCas9-Eve mRNA 作為對照）。相對而言，MO 的脫靶效應(yīng)要大很多。事實上，有實驗證據(jù)表明：即使有多達 5 bp 的錯配，MO 也會發(fā)生作用。而對于一個 25 nt 長的 MO 而言，5 bp 錯配在基因組中的類似序列可以是成白上千。因此，MO 敲降的脫靶機會很大。

另外，有研究報道注射 MO 可異常激活斑馬魚 p53 基因的表達，非特異性地誘導(dǎo)胚胎細胞凋亡，因此，在很多情況下，如果使用 MO 作基因敲降，是需要同時注射敲降 p53 基因的MO 以抑制過表達的p53（請參考已發(fā)表的文獻 Robu et al., 2007. PLoS Genet. 3(5):e78）。

再者，如果 MO 自身就存在毒性（源于序列本身或者化學(xué)合成過程），則是無法進行對照的。MO 方法剛發(fā)明不久，就有研究指出即使是同一種序列，不同批次合成的產(chǎn)品的毒性也可能是不一樣的，顯然，這種“內(nèi)在”的毒性是無法進行對照的。

五、CRISPRi 敲降工具（RNA 形式）供貨周期遠短于 MO 敲降工具

由于 MO 工具需要在美國合成，受進口手續(xù)、海關(guān)通關(guān)等的影響，到貨時間一般不少于 30 個工作日。而 CRISPRi 敲降工具（RNA 形式）完全有本公司自主生產(chǎn)（已申請國家發(fā)明專利，專利申請?zhí)枺?/span>201610843834.8），不超過 20 個工作日（一般為 10 個工作日）即可制作好，干冰寄送（到貨）。